低温保存技术在生物样本库中的应用(6)
0 引言生物样本库指收集、处理、保存人体生物材料及临床信息,并应用于生命科学研究和临床治疗的生物应用系统,生物样本库集中储存的人体生物材料包括经处理过的DNA、RNA、蛋白等生物大分子以及细胞、组织和器官[1]。大容量的生物样本信息对于理解复杂疾病的决定因素至关重要,从样本中筛选疾病的生物标志物,实现早期诊断、预测[2],配合病人的临床信息,将基础医学研究结果和临床治疗联系在一起,使生物样本库成为精准医疗的基础[3]。在精准医疗的时代背景下,生物样本库已经应用于治疗肿瘤、免疫系统疾病、糖尿病以及新药研发等医学领域中。近年来,生物样本资源受到越来越多关注,生物样本库取得了快速发展。1994年,中国科学院建立了中华民族永生细胞库,成为中国第一个生物样本库。自此,全国各大医院开始建设规范化的生物样本库[4]。在国际上,英国生物样本库(UKbiobank)、泛欧洲生物样本库与生物分子资源研究设施(BBMRI)和美国国立癌症研究所(NCI)样本库等影响力较大。英国生物样本库收集了50 万参与者的调查表数据、身体数据和生物样本,并进行随访开放了数据库[2,5],是调查疾病病因的丰富资源。生物样本质量是建设生物样本库的关键,临床研究要求生物样本提供完整的遗传信息并保持样本的功能和活性。低温环境能长期保护样本中生物大分子的信息完整性,维持细胞和组织活性,为医学科学研究提供保障[6]。建设生物样本库的目的是实际应用,因此研究针对生物样本库中细胞、组织的低温保存技术具有重要意义。本文综述了生物样本库中低温保存技术的应用现状和关键问题,总结低温保存对生物样本的损伤机制,提出低温保存技术未来的发展趋势。1 生物样本库对低温生物技术的需求精准医疗的本质是通过基因组和蛋白质组等组学技术和医学前沿技术,对大样本人群与特定疾病类型进行生物标记物分析鉴定、验证和应用,从而精确寻找到疾病的原因和治疗的靶点,并对一种疾病不同状态和过程进行精确分类,最终实现对于疾病和特定患者进行个性化精确治疗的目的,提高疾病诊治与预防的效益[7]。精准医疗必须通过大样本数据库,整合患者临床信息、表型与基因以及蛋白质谱等所有数据,需要有高质量的生物样本库。生物治疗交叉融合了现代生物技术与临床医学等多学科,实现人类重大疾病精准治疗。肿瘤免疫生物治疗已被认为是除手术、放疗和化疗外的重要治疗手段,治疗方法包括肿瘤疫苗、基因治疗、过继性免疫疗法和细胞因子治疗等[8]。基因治疗过程中使用的遗传物质、细胞因子及疫苗等生物材料都需要生物样本库提供。这些生物材料不论是储存在生物样本库中,还是在进入患者体内前,都需要处在稳定的环境中,保证重要的遗传信息和细胞功能不受损伤,不会影响治疗效果。理论上低温环境能抑制生物大分子凋零和降解,有效提高生物样本质量,因此,低温保存技术已成为生物样本库应用于生物治疗的关键。此外,低温保存技术也广泛应用于脐带血库、干细胞库和精子卵子库中,为这些重要生物资源的供受体匹配、长距离运输以及基础医学研究提供技术支持。低温保存技术也满足了个人自体储存的特别需要,甚至有望实现年轻细胞的老年使用。2 生物样本低温保存的问题随着生物与样本库的快速发展,如何获取高质量的生物样本并长期保存是建设生物样本库的关键。根据生物样本种类的不同,生物样本库通常的保存温度设置为室温、4、-20、-80 和-196 ℃(液氮)[9]。室温下可以短期保存固定组织切片;待处理的血液和DNA 等样本允许短时间保存于温度为4 ℃环境;长期保存DNA 样本需要在-20 ℃的低温环境;RNA、蛋白质、细胞和组织样本需要保存在-80 ℃或者液氮中[9]。但是低温同时也会损伤生物样本[10],目前尚存在诸多问题需要解决:1)由于RNA 与蛋白质的不稳定性,长时间保存可能带来不同程度的降解;2)添加低温保护剂保存可以使细胞保持活性,但是由于冰晶损伤、渗透压损伤及保护剂等外来物质的添加,不可避免会给细胞带来一定程度的损伤;3)低温对细胞、组织形态结构及功能的影响;4)低温对DNA、RNA 和蛋白等生物大分子的影响。样本质量是生物样本库的核心,规范化收集、处理和保存样本能够保证DNA、RNA 和蛋白等生物大分子的完整性和细胞组织的活性[11],最重要的是能保存生物样本中的有效信息。常温下,生物样本的DNA、RNA 和蛋白会随时间发生降解,影响基因的表达量[12]。分子水平的研究要求生物样本具有高质量的核酸,如RNA 完整性计数(RIN,RNA integrity number)体现了RNA 的降解程度,一般实验中RIN 大于7 的RNA 才能进行表达谱测序。保存和使用样本中的每一个步骤都会直接影响样本质量,如组织的冷缺血时间、样本的保存条件、保存时间、保存方法和保护剂种类等。LIU 等[13]对13个不同实验室使用的HeLa 细胞系进行多组学鉴定,确定了HeLa 细胞的CCL2 亚系和Kyoto 亚系等不同细胞系间的存在变异,导致相关实验研究难以重复。高质量的生物样本是医学研究的可靠数据来源,能够保障实验结果的可靠性和可重复性[14]。3 低温保存的几个关键问题目前,低温保存主要分为慢速冷冻法和玻璃化冻存法。慢速冷冻法的步骤是先将冷冻保护剂加载到样本中,然后使用程序降温仪多次、慢速地降温至某一温度并保持一段时间,最后达到目标温度后长期保存[15]。玻璃化冻存法的目的是使细胞内溶液在降温过程中形成玻璃态,细胞膜内不会出现晶态的冰,主要步骤是先加载较高浓度的低温保护剂,再将样本投入液氮进行超快速冷冻[15]。细胞低温损伤的机理尚不明确,但1972年MAZUR 等[16]提出的两因素假说仍是理解低温损伤的基 保护剂配方1949年,POLGE 等[17]首先在精子的冷冻保存中使用甘油作为低温保护剂。1959年,LOVELOCK等[18]将二甲基亚砜(DMSO)作为保护剂防止细胞的低温损伤,至今都在低温生物保存领域被广泛使用。许多研究已经证实,添加低温保护剂是减轻低温损伤的最好方法。低温保护剂分为渗透性和非渗透性两大类。渗透性保护剂包括DMSO、乙二醇、丙二醇、丙三醇、甲酰胺和乙酰胺等多元醇类;非渗透性保护剂主要包括单糖、双糖、多糖类以及聚乙二醇(PEG)和聚乙烯醇(PVA)等高分子化合物。渗透性保护剂可以渗透进细胞膜内,与胞内水分发生水合作用,增加溶液的黏性,抑制水的结晶过程,达到保护的目的[19]。同时,渗透性保护剂在降温过程中减小了细胞脱水引起的皱缩,非渗透性保护剂通常溶于水,但不能穿过细胞膜,主要与渗透性保护剂配合使用促使细胞脱水,并中和渗透性保护剂的细胞毒性;复温时,提供一个高渗环境,防止水分子进入细胞太快而引起膨胀死亡[19]。但在某些情况下,低温保护剂会在其冰点温度附近时产生细胞毒性,例如丙二醇。而亲油性低温保护剂通常具有细胞毒性。针对不同生物材料研制出高效、安全和无毒的低温保护剂一直以来是低温生物领域的难点和热点。MAKINO 等[20]在传统保护剂中加入羟乙基淀粉(HES)并在-80 ℃下保存外周血干细胞,发现6%HES 和5%DMSO 作为低温保护剂得到了最高的恢复率和存活率。滕芸等[21]使用不同质量浓度的丝胶蛋白和不同体积分数的丝素蛋白分别替代胎牛血清和DMSO,并取得了较好的低温保存效果。姚丹丹等[22]比较了4 种保护剂配方低温保存小鼠胚胎干细胞的效果,得出海藻糖可以有效维持小鼠胚胎干细胞的自我更新能力和多向分化能力。添加低温保护剂不仅提高生物样本的存活率,也对生物大分子具有一定的保护作用。SARIOZKAN 等[23]在4 ℃下冷藏小鼠精子,研究了棉籽糖、海藻糖和果糖对小鼠精子的作用,结果表明这3 种糖都可以减少小鼠精子的DNA 损伤 机械损伤尽管细胞、精子和胚胎等小尺寸生物材料已经成功通过玻璃化冻存法进行深低温保存,并且可以应用于临床治疗,但如生物组织和器官等大尺寸材料更易在降温和复温过程中受到机械损伤。要实现完全玻璃化需要样本温度快速穿越结晶温度Tm和玻璃化转变温度Tg间的温区达到Tg以下,使水分来不及结晶就转变为玻璃态。样本通过Tm-Tg温区对应的最小降温速率称为临界降温速率,同样的复温过程也存在临界加热速率,但临界加热速率通常远大于临界降温速率[24]。大尺寸生物组织的快速降温复温过程中,温度变化速率越快,生物组织内部越易产生温度梯度,导致组织内部出现热膨胀梯度引起内部热应力增大并形成微裂纹[25]。ZHAO 等[26]认为血管在空气中的低温保存过程主要在复温过程时受到热应力引起的机械损伤,因为在复温初始阶段血管弹性较差,经受热拉伸应力时更易产生裂纹。实际上,普遍使用低温保护剂溶液来低温保存生物组织,但保护剂与组织系统的热膨胀差异也会引起机械损伤。STEIF 等[27]认为保护剂-血管系统在降温过程中,裂纹先在保护剂中出现并传播到血管壁,如果血管壁足够薄或裂纹能量足够大,裂纹则会继续传播,即使裂纹在血管壁上停止传播,也会对血管最外层造成损伤。只有在适当的保护剂体积,并且系统以产生最小温度梯度的方式降温,才不太可能发生由于热膨胀差异产生的裂纹[27]。热应力引起的机械损伤也可能发生在低温保存的辅助工具上。微囊是一种免疫隔离工具,目前被广泛应用于胰岛移植、肝细胞移植和多巴胺分泌细胞移植等领域[28]。由于微囊构建材料本身的缺陷,低温保存过程中产生的热应力,容易使微囊表面产生微裂纹,改变微囊通透性和机械强度,使微囊内的细胞更易受到损伤,为微囊细胞移植带来隐患[29] 低温保存对生物大分子的影响生物样本暴露于低温环境时,来自外界的寒冷刺激改变细胞正常的生理活动,最终影响生物大分子的质量和表达,影响程度根据暴露时间和温度的不同而改变。从分子水平来看,冷冻通过改变决定亲水和疏水反应的结构,影响膜磷脂、蛋白质和核酸[30]。本文讨论的生物大分子包括DNA、RNA、蛋白质和脂类。DNA 的基因信息完整性决定了样本是否能应用于实验研究和临床治疗,所以低温保存对DNA完整性和突变的影响是关注重点。张佳年等[31-32]抽取生物样本库中低温保存的胃癌样本,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 完整性,结果表明长期低温保存对肿瘤组织 DNA 完整性影响很小。THOMSON 等[33]认为低温保存引起的DNA 损伤可能是由于低温引起的氧化应激。因此根据保存条件和样本种类,低温保存对DNA 产生不同的影响。降温方法对DNA 也有影响,MARTINEZ-BURGOS等[34]测试了玻璃化和慢速冷冻法降温保存的卵母细胞,结果得到卵母细胞没有发生DNA 片段化。ISACHENKO 等[35]的实验结果表明,低温保存会影响精子的活性,但玻璃化降温过程并不会影响精子DNA 完整性。RNA 完整性在低温保存时的变化也是样本的重要指标。RNA 质量用以评估样本整个转录组并确保其可用于临床研究。张佳年等[31-32]的实验比较不同保存年限的肿瘤样本RNA 的RIN 值,发现样本RIN 值随保存年限的增加而降低,保存超过5年的样本RNA 已经发生严重降解。OLIVIERI 等[36]的研究表明,保存在-140 ℃的头颈部肿瘤样本的RIN值与保存时间无显著关系;在-80 ℃下时,浓度为250 ng/μL RNA 保持完整性而浓度为25 ng/μL 的RNA 开始降解。这表明保存条件可能直接影响RNA 的质量,保存温度和RNA 浓度应受到严格控制。CHAMAYOU 等[37]研究了降/复温过程对MII卵母细胞mRNA 含量的影响,结果表明MII 卵母细胞在低温保存中的损伤与mRNA 含量减少引起的分子损伤有关,并且玻璃化法相比慢速冷冻法可以保持更多的mRNA 水平。低温保存对蛋白质的影响比较大,暴露于降温过程中的高浓度溶液中会引起蛋白质结构的不可逆转变[38],同时低温环境导致的氧化应激产生的自由基会损伤蛋白质[39]。由于一些蛋白质在-80 ℃下依然保持活性,当生物样本保存在蛋白质活性温度并且水还具有流动性的条件下时,正常生化反应也会导致其降解[40]。针对蛋白质低温保存的研究还包括酶活性、二级结构以及表达量等方面[9]。细胞膜的主要结构是双层磷脂膜,因此研究低温对脂类物质的影响对保存完整细胞结构有重要意义,低温对细胞膜的影响可能会改变细胞生存环境。脂类的物理状态受低温影响造成结构改变,进而影响细胞膜磷脂双分子层结构。WOLKERS 等[41]研究发现,在4 ℃下冷藏5 d 的红细胞发生了严重的相分离。冷冻引起的膜相变取决于冷冻条件,包括冰成核温度和过冷状态,以及低温保护剂的存在和类型[42]。冷冻诱导的膜相变随着成核温度的降低而减小,使膜处于相对流动的状态,因为细胞脱水的程度随着过冷的程度而降低[42]。渗透性保护剂(如甘油和乙二醇)不能防止冷冻诱导的膜相变,但会使相变在更宽的温度范围内逐渐发生[43-44]。随着低温保护剂含量的增加,冷冻存活率增加,但低温保护剂在较高浓度下会产生毒性,降低存活率。4 生物样本库对低温保存技术的要求生物样本库的最终目的是保存样本的生物信息,结合临床数据应用于生物医学研究,应防止生物样本在保存期间产生变异,影响后续实验的可靠性。脐带血库、精子卵子库和干细胞库等样本库还需要保障样本在复温后的活性和功能不受影响,才能在临床治疗中使用。新兴发展的干细胞治疗、基因治疗和免疫治疗等生物治疗手段,也需要高质量的生物样本作为基础。现阶段的低温保存技术还有较多问题需要改进。降复温速率是低温保存及技术的关键,降复温过程中的损伤机制十分复杂,包括胞内冰损伤、溶液损伤、低温断裂和重结晶等,找到适用于不同生物材料的最佳降温速率是研究的重点[45]。尽管玻璃化冻存法广泛应用于细胞等小尺寸生物材料的低温保存,但由于扩散传热和传质的局限性,大尺寸生物组织在复温过程中通常会出现反玻璃化和低温断裂。通过射频激发的磁性纳米粒子成为一种有效措施。使用磁性纳米粒子加热低温保存的生物样本,复温过程中温度分布更均匀,加热速率可以比常规边界加热技术提高几倍,并且与样品量无关[46]。在保护剂方面,研发高效且低细胞毒性的保护剂配方是研究的重点。同时,新型低温保护剂的筛选也受到关注[19]。抗冻蛋白(AFP)和抗冻糖蛋白(AFGP)是生物抗冻剂,存在于许多适应极端温度条件的物种中,例如极地鱼类以及一些昆虫和植物。这些抗冻剂通过降低凝固点,抑制冰晶形成以及稳定细胞膜的磷脂和不饱和脂肪酸而发挥作用[19,47]。AFP 和AFGP 可在精子冷冻过程中帮助保持细胞膜的完整性[48],并提高冻融后公羊、黑猩猩、小鼠、和鲷鱼的精子活力[47]。添加抗氧化剂可以在精子降温过程中抵消氧化应激产生的氧化损伤[49],包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、维生素E 和维生素C等。纳米粒子可以通过提高溶液的导热系数,改变流变学特性,增大溶液黏度,降低过冷度以及改变玻璃化性质[50-51],改善低温保存效果。但是关于低温保护剂中添加剂的加入对低温保存的优化效果还需大量研究验证。5 结论本文综述了低温保存技术在生物样本库中的应用现状和低温保存中存在的问题,分析了低温保存损伤生物样本的机制并对未来低温保存技术的发展趋势进行了展望,得出如下结论:1)低温保存技术可以长期稳定地保存生物样本的遗传信息且保证样本质量,是生物样本库应用于精准治疗的基础;2)低温保存的问题在于长期处在低温环境中不可避免会对生物样本产生损伤;3)低温保存损伤生物样本的机制包括添加保护剂会给细胞带来一定程度的损伤、生物样本在降复温过程会受到机械损伤和低温保存对生物大分子的影响;4)为了满足未来生物样本库的建设,为精准治疗提供高质量、可靠的生物样本,优化降复温过程、开发高效无毒的低温保护剂将是低温保存技术改进的关键。参考文献:[1] 郭健.生物样本库的规范化建设[J].中华临床实验室管理电子杂志, 2014, 2(4): 198-201.[2] ALLEN N, SUDLOWAC C, DOWNEY P, et al.UK Biobank: current status and what it means for epidemiology[J].Health Policy and Technology, 2012, 1(3): 123-126.[3] VAUGHT comes of age: the transition to biospecimen science[J].Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 2016, 56(1): 211-228.[4] 邢杰, 余科科, 张叶, 等.精准医学时代下胸部肿瘤生物样本库规范化建设[J].转化医学杂志, 2018, 7(4): 204-206.[5] HARVEY N C, MATTHEWS P, COLLINS R, et epidemiology in UK Biobank: a unique opportunity for international researchers[J].Osteoporosis International, 2013, 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文章来源:《中国肿瘤生物治疗杂志》 网址: http://www.zgzlswzlzz.cn/qikandaodu/2020/1227/470.html
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