低温保存技术在生物样本库中的应用(2)
3 低温保存的几个关键问题
目前,低温保存主要分为慢速冷冻法和玻璃化冻存法。慢速冷冻法的步骤是先将冷冻保护剂加载到样本中,然后使用程序降温仪多次、慢速地降温至某一温度并保持一段时间,最后达到目标温度后长期保存[15]。玻璃化冻存法的目的是使细胞内溶液在降温过程中形成玻璃态,细胞膜内不会出现晶态的冰,主要步骤是先加载较高浓度的低温保护剂,再将样本投入液氮进行超快速冷冻[15]。细胞低温损伤的机理尚不明确,但1972年MAZUR 等[16]提出的两因素假说仍是理解低温损伤的基础。
3.1 保护剂配方
1949年,POLGE 等[17]首先在精子的冷冻保存中使用甘油作为低温保护剂。1959年,LOVELOCK等[18]将二甲基亚砜(DMSO)作为保护剂防止细胞的低温损伤,至今都在低温生物保存领域被广泛使用。许多研究已经证实,添加低温保护剂是减轻低温损伤的最好方法。低温保护剂分为渗透性和非渗透性两大类。渗透性保护剂包括DMSO、乙二醇、丙二醇、丙三醇、甲酰胺和乙酰胺等多元醇类;非渗透性保护剂主要包括单糖、双糖、多糖类以及聚乙二醇(PEG)和聚乙烯醇(PVA)等高分子化合物。渗透性保护剂可以渗透进细胞膜内,与胞内水分发生水合作用,增加溶液的黏性,抑制水的结晶过程,达到保护的目的[19]。同时,渗透性保护剂在降温过程中减小了细胞脱水引起的皱缩,非渗透性保护剂通常溶于水,但不能穿过细胞膜,主要与渗透性保护剂配合使用促使细胞脱水,并中和渗透性保护剂的细胞毒性;复温时,提供一个高渗环境,防止水分子进入细胞太快而引起膨胀死亡[19]。但在某些情况下,低温保护剂会在其冰点温度附近时产生细胞毒性,例如丙二醇。而亲油性低温保护剂通常具有细胞毒性。
针对不同生物材料研制出高效、安全和无毒的低温保护剂一直以来是低温生物领域的难点和热点。MAKINO 等[20]在传统保护剂中加入羟乙基淀粉(HES)并在-80 ℃下保存外周血干细胞,发现6%HES 和5%DMSO 作为低温保护剂得到了最高的恢复率和存活率。滕芸等[21]使用不同质量浓度的丝胶蛋白和不同体积分数的丝素蛋白分别替代胎牛血清和DMSO,并取得了较好的低温保存效果。姚丹丹等[22]比较了4 种保护剂配方低温保存小鼠胚胎干细胞的效果,得出海藻糖可以有效维持小鼠胚胎干细胞的自我更新能力和多向分化能力。添加低温保护剂不仅提高生物样本的存活率,也对生物大分子具有一定的保护作用。SARIOZKAN 等[23]在4 ℃下冷藏小鼠精子,研究了棉籽糖、海藻糖和果糖对小鼠精子的作用,结果表明这3 种糖都可以减少小鼠精子的DNA 损伤。
3.2 机械损伤
尽管细胞、精子和胚胎等小尺寸生物材料已经成功通过玻璃化冻存法进行深低温保存,并且可以应用于临床治疗,但如生物组织和器官等大尺寸材料更易在降温和复温过程中受到机械损伤。要实现完全玻璃化需要样本温度快速穿越结晶温度Tm和玻璃化转变温度Tg间的温区达到Tg以下,使水分来不及结晶就转变为玻璃态。样本通过Tm-Tg温区对应的最小降温速率称为临界降温速率,同样的复温过程也存在临界加热速率,但临界加热速率通常远大于临界降温速率[24]。大尺寸生物组织的快速降温复温过程中,温度变化速率越快,生物组织内部越易产生温度梯度,导致组织内部出现热膨胀梯度引起内部热应力增大并形成微裂纹[25]。ZHAO 等[26]认为血管在空气中的低温保存过程主要在复温过程时受到热应力引起的机械损伤,因为在复温初始阶段血管弹性较差,经受热拉伸应力时更易产生裂纹。实际上,普遍使用低温保护剂溶液来低温保存生物组织,但保护剂与组织系统的热膨胀差异也会引起机械损伤。STEIF 等[27]认为保护剂-血管系统在降温过程中,裂纹先在保护剂中出现并传播到血管壁,如果血管壁足够薄或裂纹能量足够大,裂纹则会继续传播,即使裂纹在血管壁上停止传播,也会对血管最外层造成损伤。只有在适当的保护剂体积,并且系统以产生最小温度梯度的方式降温,才不太可能发生由于热膨胀差异产生的裂纹[27]。
热应力引起的机械损伤也可能发生在低温保存的辅助工具上。微囊是一种免疫隔离工具,目前被广泛应用于胰岛移植、肝细胞移植和多巴胺分泌细胞移植等领域[28]。由于微囊构建材料本身的缺陷,低温保存过程中产生的热应力,容易使微囊表面产生微裂纹,改变微囊通透性和机械强度,使微囊内的细胞更易受到损伤,为微囊细胞移植带来隐患[29]。
文章来源:《中国肿瘤生物治疗杂志》 网址: http://www.zgzlswzlzz.cn/qikandaodu/2020/1227/470.html
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