低温保存技术在生物样本库中的应用(3)
3.3 低温保存对生物大分子的影响
生物样本暴露于低温环境时,来自外界的寒冷刺激改变细胞正常的生理活动,最终影响生物大分子的质量和表达,影响程度根据暴露时间和温度的不同而改变。从分子水平来看,冷冻通过改变决定亲水和疏水反应的结构,影响膜磷脂、蛋白质和核酸[30]。本文讨论的生物大分子包括DNA、RNA、蛋白质和脂类。
DNA 的基因信息完整性决定了样本是否能应用于实验研究和临床治疗,所以低温保存对DNA完整性和突变的影响是关注重点。张佳年等[31-32]抽取生物样本库中低温保存的胃癌样本,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 完整性,结果表明长期低温保存对肿瘤组织 DNA 完整性影响很小。THOMSON 等[33]认为低温保存引起的DNA 损伤可能是由于低温引起的氧化应激。因此根据保存条件和样本种类,低温保存对DNA 产生不同的影响。降温方法对DNA 也有影响,MARTINEZ-BURGOS等[34]测试了玻璃化和慢速冷冻法降温保存的卵母细胞,结果得到卵母细胞没有发生DNA 片段化。ISACHENKO 等[35]的实验结果表明,低温保存会影响精子的活性,但玻璃化降温过程并不会影响精子DNA 完整性。
RNA 完整性在低温保存时的变化也是样本的重要指标。RNA 质量用以评估样本整个转录组并确保其可用于临床研究。张佳年等[31-32]的实验比较不同保存年限的肿瘤样本RNA 的RIN 值,发现样本RIN 值随保存年限的增加而降低,保存超过5年的样本RNA 已经发生严重降解。OLIVIERI 等[36]的研究表明,保存在-140 ℃的头颈部肿瘤样本的RIN值与保存时间无显著关系;在-80 ℃下时,浓度为250 ng/μL RNA 保持完整性而浓度为25 ng/μL 的RNA 开始降解。这表明保存条件可能直接影响RNA 的质量,保存温度和RNA 浓度应受到严格控制。CHAMAYOU 等[37]研究了降/复温过程对MII卵母细胞mRNA 含量的影响,结果表明MII 卵母细胞在低温保存中的损伤与mRNA 含量减少引起的分子损伤有关,并且玻璃化法相比慢速冷冻法可以保持更多的mRNA 水平。
低温保存对蛋白质的影响比较大,暴露于降温过程中的高浓度溶液中会引起蛋白质结构的不可逆转变[38],同时低温环境导致的氧化应激产生的自由基会损伤蛋白质[39]。由于一些蛋白质在-80 ℃下依然保持活性,当生物样本保存在蛋白质活性温度并且水还具有流动性的条件下时,正常生化反应也会导致其降解[40]。针对蛋白质低温保存的研究还包括酶活性、二级结构以及表达量等方面[9]。
细胞膜的主要结构是双层磷脂膜,因此研究低温对脂类物质的影响对保存完整细胞结构有重要意义,低温对细胞膜的影响可能会改变细胞生存环境。脂类的物理状态受低温影响造成结构改变,进而影响细胞膜磷脂双分子层结构。WOLKERS 等[41]研究发现,在4 ℃下冷藏5 d 的红细胞发生了严重的相分离。冷冻引起的膜相变取决于冷冻条件,包括冰成核温度和过冷状态,以及低温保护剂的存在和类型[42]。冷冻诱导的膜相变随着成核温度的降低而减小,使膜处于相对流动的状态,因为细胞脱水的程度随着过冷的程度而降低[42]。渗透性保护剂(如甘油和乙二醇)不能防止冷冻诱导的膜相变,但会使相变在更宽的温度范围内逐渐发生[43-44]。随着低温保护剂含量的增加,冷冻存活率增加,但低温保护剂在较高浓度下会产生毒性,降低存活率。
4 生物样本库对低温保存技术的要求
生物样本库的最终目的是保存样本的生物信息,结合临床数据应用于生物医学研究,应防止生物样本在保存期间产生变异,影响后续实验的可靠性。脐带血库、精子卵子库和干细胞库等样本库还需要保障样本在复温后的活性和功能不受影响,才能在临床治疗中使用。新兴发展的干细胞治疗、基因治疗和免疫治疗等生物治疗手段,也需要高质量的生物样本作为基础。
现阶段的低温保存技术还有较多问题需要改进。降复温速率是低温保存及技术的关键,降复温过程中的损伤机制十分复杂,包括胞内冰损伤、溶液损伤、低温断裂和重结晶等,找到适用于不同生物材料的最佳降温速率是研究的重点[45]。尽管玻璃化冻存法广泛应用于细胞等小尺寸生物材料的低温保存,但由于扩散传热和传质的局限性,大尺寸生物组织在复温过程中通常会出现反玻璃化和低温断裂。通过射频激发的磁性纳米粒子成为一种有效措施。使用磁性纳米粒子加热低温保存的生物样本,复温过程中温度分布更均匀,加热速率可以比常规边界加热技术提高几倍,并且与样品量无关[46]。
文章来源:《中国肿瘤生物治疗杂志》 网址: http://www.zgzlswzlzz.cn/qikandaodu/2020/1227/470.html
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