载阿霉素自组装多肽水凝胶的制备及体外评价(2)
1.4.3 傅里叶红外观察 将DOX、SAPH、DOX-SAPH在低温、真空下冷冻干燥,使用傅里叶红外光谱仪测试红外光谱图。
1.4.4 DOX检测方法学考察
检测波长选择:精密称取DOX 2.20 mg配制成88 mg/L的DOX溶液。于波长200-800 nm处以2 nm为单位进行全波长扫描。
FEFEFKFK干扰实验:称取适量的FEFEFKFK制成空白溶液。取空白溶液置于10 mL容量瓶,用PBS(pH=7.4)稀释至刻度,测定。取DOX对照品配成10 mg/L对照品溶液,检测比对。
DOX标准曲线的制备:室温下精密称取DOX 2.20 mg,用离子强度I=0.2 mol/L、pH=7.4的PBS配置质量浓度为88 mg/L的DOX溶液,再以此溶液配制一系列不同质量浓度的溶液。以空白缓冲液为对照,用紫外-可见分光光度计测定DOX溶液在λ=480 nm处的吸光度值。以吸光度-质量浓度作图得到DOX标准曲线。
精密度:分别配置高、中、低(56.32,14.08,3.52 mg/L)质量浓度的DOX溶液,紫外-可见分光光度计法测定DOX浓度,在1 d内每个浓度重复测量3次,考察日内精密度;同法连续测定3 d,每天1次,考察日间精密度。
1.4.5 体外释药实验 取1 mL DOX-SAPH置于已称质量的西林瓶,60 ℃恒温水浴放置2 h使其充分成胶,加入1 mL离子强度I=0.2 mol/L、pH=7.4的PBS中,置于37 ℃恒温培养摇床,震荡速率为80 r/min,定时取出全部释放介质并补充新鲜释放介质1 mL。使用紫外-可见分光光度计检测其在480 nm处的吸收强度,通过标准曲线计算溶液中DOX的浓度,以累计释药量对时间作图。取3个平行样进行测试,数据表示为平均值。
1.4.6 SAPH体外细胞相容性实验 参照浸提液细胞毒性实验标 准 (GB/T .5-2003/ISO -5:1999), 将 1 mL 20,30,40 g/L的SAPH溶液分别加入10 mL完全低糖培养基,然后置于37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱内浸提24 h。
选择生长良好的4代兔骨髓间充质干细胞接种于96孔板,接种体积为200 μL,接种细胞数为5×103/孔。37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h后,每孔加不同材料浸提液,对照组加等量的培养基(认为细胞存活率为100%),继续孵育1,3,5,7 d后,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。每孔加入CCK-8 20 μL,孵育1 h,用酶标仪测定反应液在450 nm处的吸光度值,细胞存活率通过如下公式进行计算:细胞存活率=(实验组A450-空白孔A450)/(对照组A450-空白孔A450)。
1.4.7 DOX-SAPH细胞毒性实验 参照浸提液细胞毒性实验标准,在1 mL 30 g/L的 DOX-SAPH中加入10 mL完全高糖培养基,然后置于37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱内浸提24 h。采用当量浓度,即凝胶中DOX质量浓度为2 g/L,浸提液体积为10 mL,所以DOX当量浓度是200 mg/L。将该浸提液再按1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32,1∶64,1∶128,1∶20 000等比例用完全高糖培养基稀释,即得含DOX质量浓度分别为100,50,25,12.5,6.25,3.13,1.56,0.01 mg/L的DOX-SAPH浸提液。
选择生长良好的MG63,每孔5×103个细胞接种到96孔板,每孔接种体积为200 μL。37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h后,实验组分别加入0.01,1.56,3.13,6.25,12.50,25,50,100 mg/L的DOX溶液或含0.01,1.56,3.13,6.25,12.50,25,50,100 mg/L DOX的 DOX-SAPH 浸 提 液 200 μL,对照组加等量的培养基(认为细胞存活率为100%),继续孵育1 d后采用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。每孔加入CCK-8 20 μL,孵育1 h,用酶标仪测定反应液在450 nm处的吸光度值。细胞存活率计算方法同1.4.6,并用GraphPad Prism 7.0软件计算DOX溶液和DOX-SAPH浸提液的药物半数抑制浓度(IC50)。
1.5 主要观察指标 DOX-SAPH的体外药物释放性能与生物相容性。
1.6 统计学分析 采用单因素方差(one-way ANOVA)分析进行统计学分析,实验结果表示为,当P< 0.05时认为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 DOX-SAPH的制备 将20,30,40 g/L的DOX-SAPH倒置30 min观察,凝胶仍贴附在西林瓶底部不流动,见图2。
2.2 DOX-SAPH微观形貌 测试前将 20,30,40 g/L的DOX-SAPH冻干,其形貌如图3所示,所有水凝胶均具有片状微结构,参考文献[24]可知DOX-SAPH冻干粉显微结构与SAPH冻干粉无区别。
2.3 DOX-SAPH傅里叶红外光谱分析 DOX、SAPH和20,30,40 g/L DOX-SAPH的特征傅里叶红外光谱图见图4所示,谱图出现SAPH的特征峰分别是:3 287 cm-1(-NH-),1 209 cm-1(C-N),1 625 cm-1和1 695 cm-1(β折叠),其光谱强度表现为:40 g/L>30 g/L >20 g/L。当DOX负载到SAPH上后同时出现了以上FEFEFKFK和DOX的特征吸收谱图,增加了DOX的特征峰989 cm-1(C-C-C)。
2.4 DOX检测方法学考察
2.4.1 DOX检测波长选择 DOX在480 nm波长处有最大吸收,见图5a;含FEFEFKFK的PBS溶液在480 nm处无吸收,见图5b。故选480 nm为DOX的测定波长。
文章来源:《中国肿瘤生物治疗杂志》 网址: http://www.zgzlswzlzz.cn/qikandaodu/2021/0524/622.html
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