靶向性氧化石墨烯白术内酯对卵巢癌细胞凋亡及(2)
将5 mL GO-AT-Ⅰ或RGD@GO-AT-Ⅰ溶液加入透析管(相对分子质量切断3 500)中,然后放入装有50 mL PBS (pH=7.4,含有1%十二烷基硫酸钠)的安瓶中,(37.)℃轻轻摇晃。在预先设定的时间点从安瓶取出100 μL 等份,并用100 μL新鲜介质补充,计算AT-Ⅰ总量和释放量百分比。
1.4.5 体外细胞活力分析 将人卵巢癌细胞A2780 接种到96孔板中,接种密度1×104/孔。培养24 h 后分5 组培养,分别加入PBS(对照)、RGD@GO 溶液、AT-Ⅰ溶液(20 μmol/L)、GO-AT-Ⅰ溶液(AT-Ⅰ浓度20 μmol/L)、RGD@GO-AT-Ⅰ溶液(AT-Ⅰ浓度20 μmol/L)各100 μL,处理24,48 h。随后,加入20 μL MTT 溶液(5 g/L)再培养细胞4 h。最后取出培养基,每孔加入100 μL DMSO,酶免疫法测定570 nm处各孔的吸光度A值,计算细胞存活率:细胞存活率(%)=(1-A实验组)/A对照组×100%。进行4 个平行实验,取平均值。
1.4.6 细胞周期分析 将A2780 细胞接种于6 孔板中,每孔1×106个细胞,分3组培养,分别加入PBS、GO-AT-Ⅰ溶液(AT-Ⅰ浓度20 μmol/L)、RGD@GO-AT-Ⅰ溶液(AT-Ⅰ浓度20 μmol/L)各250 μL,处理48 h。PBS 洗涤,体积分数70%冰冷乙醇固定,碘化丙啶染色,上FAC Scaliber 流式细胞仪检测。
1.4.7 细胞凋亡检测 将A2780 细胞接种于6 孔板中,每孔1×106个细胞,分3组培养,分别加入PBS、GO-AT-Ⅰ溶液(AT-Ⅰ浓度20 μmol/L)、RGD@GO-AT-Ⅰ溶液(AT-Ⅰ浓度20 μmol/L)各250 μL,处理48 h。PBS 洗涤,Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒染色,进行流式细胞术分析。
1.5 主要观察指标 RGD@GO-AT-Ⅰ的理化性质与体外抗肿瘤活性。
1.6 统计学分析 实验数据均以表示,采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。凋亡数据和细胞活力数据采用Student’st检验进行评估,P< 0.05 为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 RGD@GO-AT-Ⅰ的合成与表征 GO 片的直径为(131.) nm,厚度为(1.) nm,见图1A,B,GO 片在水中具有高度的亲水性和单分散性[11-12]。为增强细胞摄取和靶向癌细胞,将聚乙二醇(3 kD)和RGD 通过共价键与GO 的羧基结合,使纳米材料的厚度增加到(11.) nm,直径减小到(56.) nm,见图1C,D。
2.2 RGD@GO-AT-Ⅰ的载药量和体外释药 RGD@GO-AT-Ⅰ的最大载药量为(28.)%。GO-AT-Ⅰ和RGD@GO-AT-Ⅰ中释放AT-Ⅰ的曲线见图2,最初GO-AT-Ⅰ和RGD@GO-AT-Ⅰ的AT-Ⅰ释放速率很快,5 h 后药物释放进入缓慢阶段,在30 h 内,GO-AT-Ⅰ的AT-Ⅰ释放率约80%,RGD@GO-AT-Ⅰ的AT-Ⅰ释放率约为70%。
2.3 体外细胞活力实验检测结果 培养24,48 h 时,与对照组比较,RGD@GO组、AT-Ⅰ组细胞存活率无明显变化(P> 0.05),GO-AT-Ⅰ组、RGD@GO-AT-Ⅰ组细胞存活率下降(P< 0.01);与GO-AT-Ⅰ组比较,RGD@GO-AT-Ⅰ细胞存活率下降(P< 0.01),见图3。
2.4 细胞周期分析结果 各组人卵巢癌细胞的细胞周期流式细胞仪检测结果见图4。GO-AT-Ⅰ组、RGD@GO-AT-Ⅰ组亚G1期细胞比例高于对照组(P< 0.01),G0/G1期细胞比例低于对照组(P< 0.01);RGD@GO-AT-Ⅰ组亚G1期细胞比例高于GO-AT-Ⅰ组(P< 0.01),G0/G1期细胞比例低于GO-AT-Ⅰ组(P< 0.01),见表1。
表1 |各组人卵巢癌细胞细胞周期分布比例 (,%)Table 1 |Cell cycle distribution ratio of human ovarian cancer cells in each group表注:GO-AT-Ⅰ为氧化石墨烯-白术内酯Ⅰ复合物,RGD@GO-AT-Ⅰ为负载白术内酯Ⅰ的精氨酸甘氨酸天冬氨酸-氧化石墨烯复合物。与对照组比较,aP<0.01;与GO-AT-Ⅰ组比较,bP< 0.01
2.5 细胞凋亡检测结果 各组人卵巢癌细胞凋亡Annexin V-FITC 染色结果见图5。相对于对照组,GO-AT-Ⅰ组、RGD@GO-AT-Ⅰ组显示出明显的人卵巢癌细胞A2780 凋亡诱导作用(P< 0.01);相对于GO-AT-Ⅰ组,RGD@GO-AT-Ⅰ组显示出更强的人卵巢癌细胞A2780 凋亡诱导作用(P< 0.05),见表2。
3 讨论 Discussion
实验制备了负载白术内酯Ⅰ的靶向型氧化石墨烯纳米复合物,并对其抗肿瘤作用进行体外评价,结果显示RGD@GO-AT-Ⅰ可抑制人卵巢癌细胞增殖,降低人卵巢癌细胞G0/G1期百分率,促进其凋亡,提示RGD@GO-AT-Ⅰ有望成为治疗卵巢癌的靶向中药制剂。
图1 |不同纳米材料的二维表面形貌Figure 1 |Two dimensional surface morphology of different nanomaterials图注:A、B 为氧化石墨烯的原子力显微镜图像与粒径分布直方图;C、D 为负载白术内酯Ⅰ的精氨酸甘氨酸天冬氨酸-氧化石墨烯复合物的原子力显微镜图像与粒径分布直方图
图2 |不同载药纳米材料的体外白术内酯Ⅰ累积释放率Figure 2 |Cumulative release rate of atractylenolide-I from different drugloaded nanomaterialsin vitro图注:前5 h,氧化石墨烯-白术内酯Ⅰ复合物(GO-AT-Ⅰ)、负载白术内酯Ⅰ的精氨酸甘氨酸天冬氨酸-氧化石墨烯复合物(RGD@GO-AT-Ⅰ)的白术内酯Ⅰ释放速率较快,5 h 后药物释放进入缓慢阶段;30 h 内,RGD@GO-AT-Ⅰ的白术内酯Ⅰ释放率约为70%,GO-AT-Ⅰ的白术内酯Ⅰ释放率约80%
文章来源:《中国肿瘤生物治疗杂志》 网址: http://www.zgzlswzlzz.cn/qikandaodu/2021/0508/606.html
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