对结肠癌细胞生物学行为的影响及其在调控结肠(2)
2.2 结肠癌细胞SW620转染miRNA mimics后miR-126的表达情况 以脂质体LipofectamineTM2000转染miR-126 mimics入SW620细胞中,终浓度为50 nmol/L,Cel-mir-67 mimics为阴性对照(Negative control,NC),以U6为内参。数据以2-ΔΔCt方式表示。实验结果显示(图2),转染miRNA mimics 48 h后,可使低表达miR-126的结肠癌细胞株SW620中此miRNAs的表达显著上调(P<0.01)。
图1 miR-126在不同结肠癌细胞中的表达差异Fig.1 Expression of miR-126 in different colon cancer cells
图2 结肠癌细胞SW620转染miRNA mimics 后miR-126的表达Fig.2 Expression of miR-126 in colon cancer cell SW620 after mimics transfectedNote: Compared with NC group,**.P<0.01.
2.3 过表达miR-126对细胞增殖的影响 CCK8法结果显示:随着培养时间的延长,过表达miR-126组结肠癌细胞SW620的增殖能力从第3天后开始比阴性对照组下降,至第4天时差异有统计学意义(P<0.05),表明miR-126具有抑制结肠癌细胞SW620增殖的能力(图3)。
2.4 划痕实验检测miR-126对细胞迁移能力影响 对结肠癌细胞SW620进行划痕处理后,48 h后观察细胞的迁移情况,阴性对照组及miR-126 mimics转染组划痕区域相对宽度分别为(44.)%及(62.)%。miR-126 mimics转染组划痕细胞断端的距离较阴性对照组显著宽大,差异有统计学意义(P<0.05),表明miR-126可抑制SW620细胞的迁移能力。
图3 miR-126 mimics对结肠癌细胞SW620增殖能力的影响Fig.3 Effect of miR-126 mimics on proliferation of colon cancer cell SW620 after mimics transfectedNote: Compared with NC group,*.P<0.05.
图4 Western blot检测SW620细胞E-cadherin和Vimentin蛋白表达Fig.4 Expression of E-cadherin and Vimentin protein in SW620 cells
2.5 Transwell小室检测miR-126对细胞侵袭能力影响 Transwell小室结果显示,miR-126 mimics转染组穿过滤膜迁移至下室的细胞个数为(74.)个,较阴性对照组(186.)个显著减少,差异有统计学意义(P<0.05),表明miR-126具有抑制结肠癌SW620细胞侵袭的作用。
2.6 Western blot检测细胞E-cadherin和Vimentin蛋白表达情况 Western blot结果显示(图4),与阴性对照组相比,miR-126 mimics转染组SW620细胞E-cadherin的表达增加,而Vimentin表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论
EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程,是导致上皮来源的恶性肿瘤细胞发生侵袭和转移的关键步骤,因此研究结肠癌EMT发生的分子机制,寻找可以逆转结肠癌EMT的重要分子靶点,在关键步骤对结肠癌转移进行干预,理论上可更有效抑制结肠癌转移。然而,EMT相关信号通路涉及多个分子、多条信号通路,任何针对单个分子的干预方法,都难以达到理想的逆转效果。因此,有必要寻找新的手段和策略。由于单个miRNA可以同时调控多个靶基因的表达,靶向miRNA的干预理论上能更有效地逆转肿瘤。例如ZEB1 和ZEB2 已被多名研究者证实为miR-200家族的直接靶基因,在其3′-UTR区域存在多个可被miR-200家族成员互补结合的位点,外源性过表达miR-200c 可以下调ZEB1 的表达进而促进上皮细胞标志分子E-cadherin 的表达,从而抑制肿瘤EMT的发生[6-8]。
miR-126同样作为一种“抑癌性miRNA”,已在多项研究中证实其在正常组织中高表达、肿瘤组织中低表达[9,10]。本研究组前期工作亦证实,miR-126在结肠癌组织中较正常结肠组织和癌旁组织表达降低,且和淋巴结转移具有明显联系,提示miR-126可能在结肠癌的复发和转移中具有重要的作用。结肠癌细胞株SW480是一种低转移潜能的细胞系,而SW620和HCT116为高转移潜能的细胞系。研究已证实,不同转移潜能的细胞系亦具有明显的EMT表型差异。因此本研究首先观察了不同转移潜能的细胞系中miR-126的表达差异,结果证实相对于低转移潜能的结肠癌细胞SW480,miR-126在结肠癌细胞SW620和HCT116中的表达明显更低。对miR-126低表达的SW620细胞转染miRNA mimics后,发现可以抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力,进一步提示miR-126在结肠癌的发生发展中具有重要的作用。
本研究结果还表明:miR-126可以促进SW620细胞E-cadherin的表达增加,降低Vimentin的表达,提示过表达miR-126有助于抑制结肠癌EMT的发生。EMT的发生发展涉及多条信号通路,例如RhoA信号通路、EGFR/PI3K/Akt信号传导通路参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、血管生成,通过EMT调控方式参与肿瘤细胞侵袭和转移[11,12]。低表达的miR-126可能通过负调控相关靶基因,激活信号通路,促进EMT的发生,加速结肠癌的转移和复发,具体机制有待于进一步研究。
综上,结肠癌中miR-126的低表达可能存在高转移及复发风险,miR-126抑制结肠癌细胞SW620增殖、迁移及侵袭的机制可能是通过抑制EMT过程实现的,miR-126可能成为新的结肠癌分子预警标志和新的治疗靶点。
文章来源:《中国肿瘤生物治疗杂志》 网址: http://www.zgzlswzlzz.cn/qikandaodu/2021/0223/502.html