树突状细胞疫苗联合抗PD-L1抗体治疗小鼠肝癌的(3)
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恶性肿瘤已经成为危害人类健康的主要疾病,传统的治疗方法主要是手术、放疗、化疗等,但这些方法存在副作用大、易耐药、易复发等缺点。随着科学技术发展,生物治疗逐渐走进人们的视野。树突状细胞(dendritic cells,DC)是人体内目前已知功能最强大的抗原提呈细胞,能够刺激机体生成具有肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞,以抗原特异性的方式识别并清除肿瘤细胞,以DC为基础制备的肿瘤疫苗,在多种肿瘤模型动物实验及临床试验中显示出一定的治疗效果[1-3]。PD-L1(又称CD279)是人体内的负性调节蛋白,作为PD-1的配体,在肿瘤上表达,与肿瘤的侵袭性、预后、死亡风险性等密切相关[4]。有研究[5-7]报道,PD-L1在多种肿瘤中高表达,包括肝癌、肾癌、肺癌等。PD-L1与其受体PD-1结合后,对淋巴细胞产生抑制作用,促进肿瘤细胞发生免疫逃逸。因此,我们在研究中联合树突状细胞疫苗和抗PD-L1抗体,探究对小鼠肝癌的治疗效果。1材料与方法1.1实验动物、细胞和主要试剂SPF级C57BL/6J雌性小鼠,6~8周龄,购自北京华阜康生物科技股份有限公司;小鼠肝癌细胞系H22细胞由本实验室保存;抗PD-L1抗体购自bioxcell公司;重组小鼠GM-CSF和重组小鼠IL-4购自Peprotech公司;Anti-mouse CD11c-PE流式抗体购自eBioscience公司;检测干扰素γ(IFN-γ)的ELISA试剂盒购自Sigma Aldrich公司;RPMI-1640培养基,胎牛血清购自四季青Hyclone公司;红细胞裂解液购自碧云天公司小鼠髓源树突状细胞的提取、培养及鉴定将健康的6~8周龄雌性C57BL/6J小鼠颈椎脱臼处死后立即浸泡在体积分数为75%的酒精中,5 min后,在无菌环境下取出小鼠股骨和胫骨,暴露髓腔,用1640冲洗至骨髓腔成白色,细胞悬液通过200目筛网,离心,沉淀用红细胞裂解液裂解红细胞,离心后沉淀用含有20 ng/mL GM-CSF,20 ng/mL IL-4,10% FBS和1%的青链霉素的RPMI-1640培养基调整细胞数至1×106/mL,加入6孔板中培养,提取当天为第1天,第3天,第6天半量换液,第7天加入10ng/mL TNF-a诱导DC成熟。取加入TNF-a 24 h后的细胞,用抗小鼠CD11c-PE抗体染色,流式细胞仪分析细胞表面CD11c的表达小鼠髓源树突状细胞疫苗的制备将H22小鼠肝癌细胞收集到离心管中,在水浴锅和液氮中反复冻融5个循环,获得H22细胞全抗原。按照上述方法,取第7天获得的未成熟DC,与反复冻融获得的肿瘤全抗原以1∶3比例混合,并加入含10 ng/mL TNF-a,20 ng/mL GM-CSF,20 ng/mL IL-4,10% FBS的1640完全培养基,继续培养24 h,获得成熟的树突状细胞疫苗小鼠肝癌模型建立及肿瘤治疗试验取C57BL/6J小鼠40只,将5×105的H22肝癌细胞接种于每只小鼠左侧腋下。3 d后,小鼠随机分成4组,每组10只。分组如下:DC疫苗治疗组,在肿瘤接种后第3天与第10天,将1×106经过肿瘤全抗原刺激后的成熟DC注射进小鼠右侧腹皮下;抗PD-1抗体治疗组,在肿瘤接种后第3天与第10天,将100 μg抗PD-1抗体注入小鼠腹腔内。肿瘤接种后28 d,处死小鼠,用游标卡尺测量肿瘤长、短径,按照公式计算肿瘤大行∈罅馨拖赴琢錾鄙耸笛橹琢鼋又趾?8 d,处死小鼠后,在无菌环境下,取对照组和不同治疗组小鼠的脾脏。在无菌200目筛网上研磨,获得单细胞悬液,裂解红细胞后,加入到淋巴细胞分离液,离心后按照说明书取淋巴细胞层,获得小鼠脾淋巴细胞,一部分作为效应细胞,另一部分用来检测干扰素γ的分泌。H22肝癌细胞作为靶细胞,根据LDH说明书确定最佳靶细胞数量,按效靶比5∶1,10∶1和40∶1接种到U型底96孔板中,严格按照说明书操作干扰素γ水平的检测将上述得到的小鼠脾淋巴细胞的一部分作为效应细胞,H22肝癌细胞作为靶细胞,按照效靶比20∶1混合于U型底96孔板中培养72 h后,使用小鼠干扰素γ酶联免疫试剂盒,按照说明书流程检测培养上清中IFN-γ的含量统计学分析采用GraphPad Prism软件处理数据。实验数据以“均数±标准差”表示,组间比较采用t检验,P<0.05,具有统计学意义。2结果2.1小鼠髓源树突状细胞的培养及鉴定光学显微镜下观察,第1天,细胞圆且清亮,均匀悬浮于培养基中。细胞培养过程中,逐渐出现增殖性集落,并且细胞出现不规则形状,部分细胞出现“毛刺状”突起;细胞培养第7天,集落呈半悬浮状态,且大部分细胞表面有突起结构。分别收集提取小鼠骨髓第1天的骨髓细胞和培养7 d后的细胞,用抗CD11c-PE抗体对其染色,用流式细胞分析仪检测CD11c+细胞的百分比含量。结果显示,骨髓细胞提取当天CD11c+细胞比例为0.7%,见图1a。经IL-4和GM-CSF因子诱导扩增7 d后,CD11c+细胞的比例为99%,见图1b。说明经过因子诱导后,获得了大量高纯度的树突状细胞肿瘤生长情况树突状细胞疫苗和抗PD-L1抗体联合治疗组肿瘤大小明显小于对照组,以及单独使用疫苗组和单独使用抗体治疗组;树突状细胞疫苗和抗PD-L1抗体单独治疗组肿瘤分别与对照组相比也显著缩小,见表1。图1 小鼠骨髓CD11c+细胞比例表1不同治疗组肿瘤大小、脾淋巴细胞杀伤率及干扰素γ的分泌水平组别肿瘤大小/mm2杀伤率/%干扰素γ水平/(pg·mL-1)对照组187.树突状细胞疫苗治疗组95.#43.#560.#抗PD-L1抗体治疗组122.#36.#478.#联合治疗组78.?57.?887.?# 与对照组比较,P<0.001;* 与另外三组比较,P<0.0022.3细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用树突状细胞疫苗和抗PD-L1抗体联合治疗组的脾淋巴细胞对H22肝癌细胞杀伤率明显高于对照组,以及使用疫苗组和抗体单独治疗组;树突状细胞疫苗和抗PD-L1抗体单独治疗组分别与对照组相比,杀伤率也显著提高,见表干扰素γ分泌水平树突状细胞疫苗和抗PD-L1抗体联合治疗组的脾淋巴细胞与H22肝癌细胞共孵育分泌的干扰素γ显著高于对照组,以及疫苗和抗体单独治疗组;树突状细胞疫苗和抗PD-L1抗体单独治疗组干扰素γ的分泌水平分别与对照组相比,也显著提高,见表1。3讨论我国原发性肝癌的病死率仅次于肺癌,且起病隐匿,不易早期诊断,手术切除难度大,危险性高,且对放化疗不敏感。因此探索更有效的肝癌治疗方案成为一个亟待解决的问题。随着免疫治疗的研究不断深入,其应用范围也不断扩大,树突状细胞疫苗因其出色的治疗效果成为免疫治疗研究的热点,因此将树突状细胞疫苗应用于肝癌治疗中可能成为一种潜在的有效治疗方案。树突状细胞作为体内功能最强的抗原提呈细胞,将摄取的肿瘤抗原加工处理后,提呈给T细胞,促进T细胞激活。活化的CD8+T细胞能够直接识别DC递呈的肿瘤抗原,从而杀死肿瘤细胞,而CD4+T细胞活化后,通过分泌干扰素,白介素2等细胞因子来辅助CD8+T细胞对肿瘤的杀伤作用。通过反复冻融肿瘤细胞获得肿瘤细胞的完全抗原,并用其负载体外培养扩增的DC,制备成DC疫苗。DC疫苗目前已经应用于多种肿瘤的治疗,部分取得了不错的治疗效果。然而,肿瘤能够通过多种免疫逃逸机制,逃避T细胞的杀伤,DC疫苗单独使用的临床效果并不是很理想,客观有效率只有12.7%[8]。因此,如何阻止肿瘤发生免疫逃逸成为免疫治疗成功与否的关键。免疫检查点是一系列具有负性调节功能的蛋白,在免疫系统中起到“刹车作用”,防止过度激活的T细胞对机体自身产生炎性损伤。但肿瘤利用这一特点,过度表达免疫检查点,从而抑制T细胞对肿瘤发挥杀伤作用。机体发生肿瘤后,PD-1/PD-L1这对免疫检查点在机体内过表达,降低组织中T细胞的活性,抑制其杀伤作用,形成肿瘤微环境中的免疫耐受。目前,DC疫苗与PD-L1抗体已经联合应用于多种小鼠肿瘤模型的治疗中[9],因此,我们将抗PD-L1抗体与DC疫苗联合应用于小鼠肝癌模型中,使DC疫苗将肝癌抗原有效递呈给T细胞后,刺激T细胞活化,对肿瘤发挥杀伤作用。与此同时,给予抗PD-L1抗体,抑制PD-1/PD-L1通路的激活,从而使肿瘤无法在微环境中发生免疫逃逸。我们发现,DC疫苗与抗PD-L1抗体联合治疗显著抑制了肿瘤生长,且抑制效果好于单独治疗效果,这意味着抗PD-L1抗体对DC疫苗治疗肿瘤效果起到协同作用。通过细胞毒性试验和细胞因子分泌水平检测抗肿瘤治疗的免疫反应机制。相比于单独治疗,联合治疗组小鼠的脾淋巴细胞有更高的细胞毒性,提示抗PD-L1抗体提高了CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。在细胞因子分泌检测试验中,联合治疗组小鼠的脾淋巴细胞与肿瘤细胞共孵育后能够分泌更多的干扰素γ,表明联合治疗提高了CD4+T细胞分泌因子的活性,并且干扰素γ能够激活CD8+T的杀伤活性。综合实验结果,我们发现DC疫苗与抗PD-L1联合应用能够有效的提高对肝癌的治疗效果。为临床的肝癌治疗提供了一条新思路,具有广泛的应用前景。参考文献:[1] 王征帆,王豪勋,李楠,等. 原发性肝癌PD-L1和PD-L2表达[J].医药论坛杂志,2017,(02):14-15.[2] 任书荣,王秋波,张艳丽,等. 树突状细胞疫苗联合Imiquimod对小鼠乳腺肿瘤的治疗作用[J].免疫学杂志,2016,(10):890-894.[3] 吴圣,邵婧怡,王芳,等. PD-L1和PD-1在胃癌组织中的表达及其临床意义[J].安徽医科大学学报,2015,(06):821-825.[4] HERBST R. S, BAAS, P, KIM D. W, et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): A randomised controlled trial [J]. The Lancet, 2016,387():1540-1550.[5] 冯钟煦,刘剑勇,赵荫农,等. H22细胞全细胞抗原负载的树突状细胞激活肿瘤浸润性淋巴细胞抗小鼠肝癌的实验[J].肿瘤防治研究,2012,(10):1179-1182.[6] 韦思明,颜志中,周剑. 树突状细胞疫苗联合抗CD137抗体治疗肾细胞癌的实验研究[J].浙江医学教育,2012,(04):47-50.[7] 马薇,罗殿中,陈源,等. PD-L1和PD-1在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义[J].实用医学杂志,2011,(09):1551-1554.[8] DRAUBE A, KLEIN-GONZáLEZ N, Mattheus S, et al. Dendritic cell based tumor vaccination in prostate and renal cell cancer: a systematic review and meta-analysisc [J]. PLoS One, 2011,6(4):e.[9] GE Y, XI H, JU S, et al. Blockade of PD-1/PD-L1 immune checkpoint during DC vaccination induces potent protective immunity against breast cancer in hu-SCID mice [J]. Cancer Letters, 336(2), 253-259.
文章来源:《中国肿瘤生物治疗杂志》 网址: http://www.zgzlswzlzz.cn/qikandaodu/2020/1016/373.html